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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 1976 (2023) Citar este artículo

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Investigamos la respuesta fisiológica y transcriptómica de Escherichia coli en la fase estacionaria temprana a diodos emisores de luz con diferentes longitudes de onda. El crecimiento y los cambios metabólicos de E. coli O157:H7 se examinaron bajo la influencia de luz iluminada de 465, 520 y 625 nm. Bajo una iluminación de 465 nm, el crecimiento de E. coli O157:H7 se retrasó significativamente en comparación con la iluminación de 520 nm y 625 nm y el control sin iluminación. Los cambios metabólicos se examinaron bajo estas condiciones de iluminación y sin iluminación basadas en lecturas transcriptómicas. La respuesta transcriptómica por debajo de 520 nm y 625 nm se mantuvo casi similar al control, excepto por algunos genes regulados hacia arriba y hacia abajo. Las lecturas transcriptómicas metabólicas de los carbohidratos estaban muy reguladas a la baja bajo una iluminación de 465 nm en comparación con la iluminación de 520 nm y 625 nm y el control no iluminado que muestra el agotamiento de la glucosa como única fuente de energía durante la fase exponencial. La degradación de los ácidos grasos, como los genes relacionados con el regulón de moda, se reguló positivamente en las células bajo una iluminación de 465 nm, lo que revela el cambio de las células para utilizar el ácido graso como una nueva fuente de energía de carbono durante la fase estacionaria temprana. Exposición de células de E. coli O157:H7 a genes del factor de virulencia regulados negativamente con luz iluminada de 465 nm, como hlyA, hlyB, hlyC, stx1A, stx2B, paa y bdm. Bajo el estrés de la iluminación de 465 nm, la expresión del estrés y los genes relacionados con la motilidad flagelar se regularon positivamente, lo que provocó el consumo de energía y la reducción del crecimiento celular. Además, las lecturas transcriptómicas fosforiladas oxidativas se regularon positivamente bajo una iluminación de 465 nm, probablemente debido a la producción de ROS que podría implicar la reducción del crecimiento celular durante la fase estacionaria temprana. Estos resultados indican que la patógena E. coli O157:H7 responde de manera diferencial a una longitud de onda diferente de los diodos emisores de luz utilizados en este estudio.

La producción de plantas de interior con diodos emisores de luz artificial es de gran interés hoy en día teniendo en cuenta la producción de hortalizas orgánicas en un entorno de control limpio y preciso y el combate de los recursos de la tierra y los factores ambientales1. En fábricas de interior se han cultivado con éxito diferentes tipos de hortalizas, como tomates, patatas, chiles, coles y lechugas1. La luz, la temperatura, la humedad, el aire y la nutrición son los factores más esenciales para el crecimiento de las plantas. Las fábricas de plantas de interior bajo ambientes controlados tienen un mayor potencial de producción y ventajas en comparación con la horticultura tradicional. Como ya se ha informado que el cambio climático está implicado en grandes pérdidas en la producción de alimentos2,3. Además, el cambio climático con desastres naturales tiene un impacto negativo en la producción de cultivos agrícolas importantes, como la producción de maíz en el noreste de China, que se redujo a la mitad entre 1997 y 20174. Se estima que estos cambios climáticos extremos pueden provocar una grave escasez de alimentos y hambre durante 170 años. millones de personas para el año 20805,6.

Para hacer frente a la escasez de alimentos, la producción de plantas de interior se considera el mejor enfoque alternativo que necesita luz artificial para la fotosíntesis de las plantas. Entre las luces artificiales, los diodos emisores de luz (LED) se consideran la mejor opción al tener varias ventajas como la ausencia de lámparas de mercurio de baja presión (LPM), tamaño pequeño, larga vida útil, no térmico y también pueden usarse eficientemente para aumentar los valores nutricionales. y controlar la población microbiana en plantas y vegetales7,8. El efecto de los LED con diferentes longitudes de onda se ha estudiado previamente para investigar sus efectos en verduras y frutas. Los LED de 660 nm fueron eficaces para la acumulación predominante de carotenoide (β-cry) en las mandarinas Satsuma9. Además, los LED azules (465 nm) y rojos (625 nm) en las plántulas de guisantes aumentaron la concentración de clorofila y β-caroteno10.

La producción de productos agrícolas frescos ha aumentado al 64,8% en Corea durante la última década11. Del mismo modo, la industria de los kits de comida también está floreciendo en todo el mundo: se observó un crecimiento del 300 % en los Estados Unidos (EE. UU.) en 2017, valorado en 4,65 mil millones de dólares estadounidenses11. Tanto los productos recién cortados de las fábricas de plantas de interior como los kits de comida contienen diversas verduras que normalmente se consumen sin procesar. Escherichia coli O157:H7 es conocida como el patógeno más común en productos frescos y causa enfermedades en humanos como colitis hemorrágica, diarrea con sangre y síndrome urémico hemolítico12. De 2008 a 2020 se notificaron un total de 515, 165 y 235 casos de brotes transmitidos por alimentos en productos frescos debido a E. coli enterohemorrágica (EHEC) en los EE. UU., el Reino Unido (RU) y Canadá, respectivamente13,14,15 . Hasta ahora, no se ha reportado ningún brote en las fábricas de plantas de interior, sin embargo, con el avance y la necesidad de las fábricas de plantas de interior, también han aumentado las posibilidades de contaminación de vegetales debido a E. coli O157:H7.

Para reducir las enfermedades transmitidas por los alimentos, especialmente la inactivación de E. coli O157:H7 en productos frescos, es esencial un paso de desinfección. El lavado de hojas tiernas, hortalizas o frutos rojos podría modificar su forma y apariencia debido a su frágil estructura y provocaría la pérdida de su valor comercial. Los productos frescos podrían tener un alto crecimiento microbiano sin pasos de lavado después del período poscosecha16,17. Un método para matar microbios es la luz ultravioleta (UV) utilizada con LPM, que interfiere con la replicación del ADN y provoca la muerte de las células microbianas18. Sin embargo, la irradiación UV no se recomienda en la industria alimentaria debido a sus graves riesgos físicos y químicos19. Los LED emergen como una alternativa potencial a otros tratamientos y uso en el tratamiento superficial de productos frescos. Los estudios han demostrado que los LED UV tienen la capacidad de controlar el crecimiento microbiano en diferentes productos de frutas y verduras20. Según la composición y el material semiconductor, los LED pueden diseñarse para emitir la longitud de onda deseada19. Se investigó el efecto antibacteriano de los LED con diferentes longitudes de onda contra patógenos transmitidos por los alimentos y se encontró que los LED azules (461 nm) y verdes (521 nm) eran eficaces para controlar estos patógenos21,22.

Los efectos de inhibición de los LED de diferentes longitudes de onda contra E. coli O157:H7 se han investigado previamente en productos frescos23. Los estudios demostraron que las moléculas intracelulares de las bacterias absorben longitudes de onda de luz que afectan su crecimiento22. Sin embargo, los cambios en la expresión del genoma basados ​​en secuencias transcriptómicas de E. coli O157:H7 bajo tratamiento con diferentes longitudes de onda no se han informado anteriormente. Las secuencias transcriptómicas proporcionan información útil para examinar los cambios en las características genómicas y metabólicas de una sola especie microbiana al comparar varios entornos, incluido el estrés de diferentes longitudes de onda. Por lo tanto, en este estudio, examinamos el crecimiento de E. coli O157:H7 bajo el estrés de luz de diferentes longitudes de onda, extrajimos sus ARN totales y los secuenciamos para comprender su respuesta a la exposición prolongada a LED azules, verdes y rojos. Iluminación a nivel molecular.

Se encontró que tres LED diferentes (azul, verde y rojo) tenían picos de intensidad en longitudes de onda de 465, 520 y 625 nm, respectivamente (Tabla 1). Dado que la iluminación LED durante mucho tiempo podría aumentar la temperatura del medio de crecimiento, se monitoreó la temperatura de TSB durante 4 h durante la iluminación LED para seleccionar la condición de temperatura óptima para el crecimiento celular bajo iluminación LED. Independientemente de la longitud de onda, la iluminación LED dio como resultado un aumento de aproximadamente 0,5 °C en la temperatura de la TSB, en comparación con la temperatura establecida de la incubadora (datos no mostrados). Por lo tanto, la temperatura para el crecimiento celular bajo iluminación LED se ajustó a 24,5 °C para eliminar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento celular.

Las curvas de crecimiento promedio para células E. coli O157:H7 cultivadas en condiciones de oscuridad o con cada iluminación LED ajustada al modelo de Baranyi (Fig. 1). El coeficiente de determinación (valores R2) para las curvas de crecimiento ajustadas fue superior a 0,99 (datos no mostrados). El patrón de crecimiento de E. coli O157:H7 se alteró mediante iluminación LED con diferentes longitudes de onda. El crecimiento celular en condiciones de oscuridad (control) fue similar al de 520 nm, mientras que los patrones de crecimiento de las células durante la iluminación LED de 465 y 625 nm fueron diferentes de los de las células de control en TSB a 25 °C. Los parámetros de crecimiento de E. coli O157:H7 sin iluminación y con LED se calcularon en función de las curvas de crecimiento ajustadas (Tabla 2). No hubo diferencias significativas (P <0,05) en los valores de LPD entre el control y 520 nm, y el control y 625 nm, respectivamente, mientras que las células cultivadas con iluminación de 465 nm tuvieron fases de retraso más largas que las demás. De manera similar, se observaron GR más bajos y DT más altos en las células cultivadas con iluminación de 465 nm que las de las células de control. Además, las células bajo iluminación de 465 nm alcanzaron un MPD significativamente (P <0,05) menor en comparación con el control. A diferencia de 465 nm, no se cultivan diferencias significativas en los valores de DT y MPD entre el control y las células bajo iluminación de 625 nm. Estos resultados indican que el crecimiento celular estuvo muy influenciado por la iluminación LED de 465 nm, mientras que los LED de otras longitudes de onda no. Sobre la base de las curvas de crecimiento, la fase estacionaria temprana se determinó a las 17 h para el control no iluminado y las células con iluminación de 625 nm, mientras que se alcanzó a las 18 h y 29 h para las células con iluminación de 520 nm y 465 nm, respectivamente. . Las células recolectadas en la fase estacionaria temprana se sometieron a análisis de secuencia de ARN.

Supervivencia del crecimiento de E. coli O157:H7 bajo la influencia de luz de diferentes longitudes de onda. El crecimiento de las células en condiciones de oscuridad sirvió como control.

La PCA se realizó para examinar las similitudes y diferencias en las lecturas transcriptómicas entre muestras bajo iluminación y control de 465, 520 y 625 nm (Fig. 2A). Las variaciones genéticas máximas en estos 4 grupos fueron 56,8% (PC1) y 33,3% (PC2) con una separación y formación de grupos aceptables, lo que ilustra que los genes de E. coli O157:H7 reaccionaron de manera diferente a 465 nm, 520 nm, 625 nm. iluminación y control. Además, las lecturas transcriptómicas de las células tratadas con iluminación de 520 nm y 625 nm fueron más cercanas a las del control, mientras que fueron totalmente diferentes de las lecturas transcriptómicas de las células tratadas con iluminación de 465 nm, lo que demuestra que la iluminación de 465 nm podría inducir grandes cambios en el transcriptoma en E. coli O157:H7 en comparación con el control no iluminado y la iluminación de 520 nm y 625 nm. Los DEG en condiciones de iluminación también se compararon con el control con un cambio de pliegue ajustado (FC)> 2 y P <0,05 (Fig. 2B). Bajo iluminación LED de 465 nm, una mayor proporción de genes estaban sobreexpresados ​​(513 genes) y subexpresados ​​(495 genes) en comparación con 520 nm (88 genes regulados positivamente; 62 genes regulados negativamente) y 625 nm (13 genes regulados positivamente). regulados; 15 genes regulados negativamente) Iluminación LED en comparación con el control. Los niveles de expresión génica adicionales bajo iluminación y control de 465 nm se compararon y visualizaron como diagramas de dispersión con un FC ajustado> 2 y P <0,05 (Fig. 2C). El diagrama de dispersión presenta el significado y las diferencias en las lecturas transcriptómicas. Además, se evaluó la respuesta transcripcional de E. coli O157:H7 bajo diferente iluminación LED (Tabla 3). Los resultados mostraron una regulación significativa hacia arriba o hacia abajo de genes en células de E. coli O157:H7. El mayor número de genes en los que la expresión se vio significativamente afectada se produjo después de la exposición de E. coli O157:H7 a una iluminación LED de 465 nm; sin embargo, para el control, iluminación de 520 nm y 625 nm, el número de genes aumentó significativamente o La regulación negativa fue bastante similar. La iluminación LED de 465 nm también redujo significativamente los genes relacionados con los factores de virulencia (hlyA, hlyB, hlyC, hlyE, stx1A, stx2A, paa) y las proteínas flagelares (csgF, csgC, ​​fimC, fimD) en comparación con el control, 520 nm y 625 Iluminación LED de nm.

Análisis de componentes principales (PCA) de la expresión de genes de E. coli O157:H7 tratados bajo diferentes longitudes de onda de luz. El crecimiento de las células en condiciones de oscuridad sirvió como control. La escala de varianza unitaria se aplica a las filas; Para calcular los componentes principales se utiliza SVD con imputación. Los ejes X e Y muestran el componente principal 1 y el componente principal 2 que explican el 56,8% y el 33,3% de la varianza total, respectivamente. N = 4 puntos de datos (A), Distribución de genes expresados ​​diferencialmente (DEG). El eje X es la comparación de diferentes grupos (B, 465 nm; G, 520 nm; R, 625 nm; C, control) y el eje Y es el número de DEG (B) y el diagrama de dispersión para mostrar la distribución. de DEG. El color gris representa no DEG y los genes dispersos a lo largo del eje X-Y indican los genes que eran sobreabundantes bajo la luz iluminada azul de 465 nm y el Control (C).

Para examinar las características metabólicas de E. coli O157:H7, la cepa se cultivó bajo iluminación LED y en condiciones sin iluminación, y se analizó el transcriptoma. Las actividades relativas de los genes funcionales se calcularon a través de la abundancia relativa de lecturas de ARNm de E. coli O157:H7 a partir del número total de lecturas de ARNm de E. coli O157:H7. Las lecturas de ARNm de E. coli O157:H7 se asignaron funcionalmente a cada categoría metabólica de KEGG (Fig. 3). Las distribuciones KEGG de las lecturas de ARNm de E. coli O157:H7 bajo iluminación LED de 465 nm fueron diferentes del control no iluminado y de la iluminación LED de 520 nm y 625 nm. Las transcripciones de ARNm en el nivel primario se asignaron predominantemente a la categoría metabólica en las cuatro condiciones (Fig. 3A). En el nivel secundario, las transcripciones de ARNm en el caso del control no iluminado y la iluminación LED de 520 nm y 625 nm se asignaron predominantemente a la categoría de metabolismo de carbohidratos; sin embargo, en el caso de la iluminación LED de 465 nm, las transcripciones de ARNm se asignaron igualmente predominantemente a Metabolismo de carbohidratos y categorías de traducción también (Fig. 3B). En el caso de la iluminación LED de 465 nm, las lecturas de ARNm para el metabolismo de los carbohidratos disminuyeron, lo que provocó un retraso en el crecimiento de E. coli O157:H7. En el caso del control no iluminado y la iluminación de 520 nm y 625 nm, las segundas lecturas de ARNm más abundantes se asignaron a la categoría de transporte de membrana y fueron significativamente más altas que las lecturas de ARNm bajo E. coli O157:H7 iluminada a 465 nm (Fig. 3B). ). En el caso del control no iluminado y la iluminación LED de 520 nm y 625 nm, las segundas lecturas de ARNm más abundantes se asignaron a la categoría de transporte de membrana y fueron significativamente más altas que las lecturas de ARNm bajo E. coli O157:H7 iluminada por LED de 465 nm ( Figura 3B). Además, las lecturas de ARNm de E. coli O157:H7 en el nivel terciario mostraron las subcategorías de metabolismo de carbohidratos y categorías de procesamiento de información ambiental (Fig. 3C). Los genes de procesamiento de información ambiental involucrados principalmente en los transportadores ABC y la vía del sistema PTS, que están involucrados en el metabolismo de los carbohidratos y responden a las condiciones del sistema ambiental, se regularon negativamente bajo iluminación LED de 465 nm. En casi todas las categorías del nivel terciario, las lecturas de ARNm en el caso de la iluminación LED de 465 nm disminuyeron significativamente en comparación con el control no iluminado y la iluminación LED de 520 nm y 625 nm.

Expresión transcripcional de Escherichia coli O157:H7 (RPKM, números de lectura por kilobase de cada secuencia codificante, por millón de lecturas mapeadas) de categorías funcionales representativas de KEGG en los niveles primario (A), secundario (B) y terciario (C) tratados bajo diferentes longitudes de onda de luces. El crecimiento de las células en condiciones de oscuridad sirvió como control.

Las características metabólicas de E. coli O157:H7 se examinaron más a fondo mediante el mapeo de lecturas de ARNm de células bajo diferentes luces iluminadas y no iluminadas por LED en las vías KEGG (Fig. 4). El análisis transcriptómico metabólico de KEGG mostró que algunas vías metabólicas de E. coli O157:H7 bajo iluminación LED de 465 nm también estaban reguladas positivamente, como las implicadas en la traducción y el metabolismo energético. Sin embargo, muchos otros genes, como las vías metabólicas implicadas en el metabolismo de los carbohidratos y el transporte de membranas, estaban regulados negativamente en comparación con el control no iluminado y la iluminación LED de 520 nm y 625 nm. Una variedad de lecturas transcriptómicas relacionadas con la fosforilación oxidativa (Fig. 5A), la degradación de ácidos grasos (Fig. 5B) y el ensamblaje flagelar (Fig. 5C) se regularon positivamente en células bajo iluminación LED de 465 nm en comparación con las lecturas transcriptómicas de E. .coli O157:H7 bajo control no iluminado. Como en los genes de fosforilación oxidativa nuoA a nuoN que codifican un NADH: la ubiquinona oxidorreductasa estaba regulada positivamente, sin embargo, los genes que codifican el complejo citocromo o oxidasa cyoBCDE estaban regulados negativamente tras la exposición de las células bajo iluminación LED de 465 nm. Varios genes de deshidrogenasa también se regularon negativamente tras la exposición a iluminación LED de 465 nm, por ejemplo, los genes que codifican la succinato deshidrogenasa sdhABCD y los genes que codifican la fumarato reductasa frdABCD. Estos genes participan en la reducción de la ubiquinona a ubiquinol, que dona un electrón a las oxidasas terminales, el citocromo o o los complejos del citocromo d que oxidan el ubiquinol y reducen el oxígeno molecular a agua. La regulación negativa de los componentes de la cadena de transporte de electrones (ETC) ilustró que las células bajo iluminación de 465 nm no eran lo suficientemente saludables para la respiración aeróbica en comparación con las células de control sanas no iluminadas (Fig. 5A). Parece que las células consumen ácidos grasos como única fuente de carbono y energía con varias cadenas. Las células de E. coli absorben ácidos grasos y los degradan mediante la vía de β-oxidación o utilizan ácidos grasos para la biosíntesis de fosfolípidos de membrana. El regulón de moda enzimática participa en la catálisis de estas vías de degradación que activan y transportan ácidos grasos de cadena larga y se degradan en acetil CoA (Tabla 3, Fig. 5B). En el presente estudio, los genes fadL, fadJ, fadI, fadH, fade y fadD implicados en la producción de acetil CoAs estuvieron significativamente regulados positivamente a 6,12, 6,53, 5,64, 3,05, 4,97 y 5,73 log2, respectivamente, bajo iluminación LED de 465 nm en comparación con 520 nm (4.75, 4.85, 4.11, 0.41, 3.41 y 4.10 log2, respectivamente) y 625 nm (5.28, 5.22, 4.24, 0.01, 3.78 y 4.39 log2, respectivamente) celdas de control iluminadas y no iluminadas (5.97, 5.21, 4.82, 4.82 , − 0,19, 3,68 y 4,66 log2, respectivamente) (Tabla 3, Fig. 5B). Los genes que codifican la motilidad estaban regulados positivamente en las células bajo iluminación LED de 465 nm en comparación con las células de control (Fig. 5C). Como el gen regulador maestro del flagelo flhD, los genes fli y flg están involucrados en la regulación, biosíntesis y ensamblaje del flagelo, y la proteína del complejo motor motB se reguló positivamente en E. coli O157:H7 tras la exposición a una iluminación de 465 nm.

Expresión transcripcional de las vías metabólicas de E. coli O157:H7 tratadas con diferentes longitudes de onda de luz. El crecimiento de las células en condiciones de oscuridad sirvió como control. Las rutas metabólicas de KEGG se generaron utilizando el genoma de la cepa E. coli O157:H7; sus niveles de expresión transcripcional se representan cuantitativamente mediante el grosor de la línea y los cambios de color, de acuerdo con sus números de lectura por kilobase de cada secuencia codificante, por millón de valores de lecturas mapeadas (RPKM).

Genes regulados negativamente (azul) y regulados positivamente (naranja) de E. coli O157:H7 bajo la influencia de luz iluminada azul (465 nm) en comparación con el control en la vía de fosforilación oxidativa (A), degradación de ácidos grasos (B) y conjunto flagelar (C). El análisis de la ruta de los genes seleccionados se realizó utilizando la base de datos KEGG.

La exposición de células E. coli O157:H7 a diferentes longitudes de onda de LED indujo cambios transcripcionales como se describe en el presente estudio. Anteriormente, se investigó el efecto de los LED contra bacterias patógenas y se descubrió que los LED azules (461 nm) y verdes (521 nm) eran eficaces para controlar estos patógenos21,22. En el presente estudio, se utilizaron tres luces iluminadas por LED diferentes para examinar sus efectos sobre el crecimiento bacteriano y se encontró que las células de E. coli O157:H7 responden de manera diferencial a la luz iluminada de 465 nm, como lo describen Ghate et al.21. Estos hallazgos podrían elaborarse mediante el mecanismo de tratamiento fotodinámico implicado en la inactivación bacteriana. El tratamiento fotodinámico induce la excitación de moléculas fotosensibilizadoras que producen especies reactivas de oxígeno (ROS) al absorber longitudes de onda entre 400 y 500 nm21,24. Luego, las ROS oxidan los constituyentes de la membrana celular y causan efectos citotóxicos21,25.

Según las diferencias transcripcionales en E. coli O157:H7, bajo la influencia de diferentes LED, la luz iluminada afectó el espectro de crecimiento (Fig. 1). Por lo tanto, se compararon las lecturas transcriptómicas de E. coli O157:H7 cultivadas en estas condiciones. Se observó una cantidad significativa de DEG para E. coli O157:H7 cultivada con iluminación de 465 nm en comparación con iluminación de 520 nm y 625 nm y control sin iluminación (Fig. 2). A partir de E. coli O157:H7, espectro de crecimiento bajo diferentes luces iluminadas por LED, asumimos que las luces LED afectan el ADN, las proteínas o los lípidos. Con base en lecturas transcriptómicas de E. coli O157:H7 en condiciones iluminadas y no iluminadas, se analizaron las categorías metabólicas de KEGG (Fig. 3). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en los valores de RPKM para el metabolismo de aminoácidos y lípidos (Fig. 3B). Por lo tanto, la oxidación de proteínas y lípidos no es suficiente para elaborar diferentes niveles de crecimiento de E. coli O157:H7 cultivada en diferentes condiciones de estrés. Según el análisis KEGG, los procesos biológicos, metabólicos y celulares tienen la mayor cantidad de DEG.

Los procesos metabólicos de E. coli O157:H7 en la fase estacionaria inicial podrían identificarse basándose en las rutas KEGG, que muestran una red de moléculas que interactúan (Fig. 4). En las células bacterianas, las proteínas transportadoras del casete de unión a ATP (ABC) contienen dos dominios transmembrana (TMD) y dos dominios de unión a nucleótidos (NBD)26. Los NBD implican la unión e hidrolización de ATP y cambios estructurales en los TMD para la apertura de conductos para transportar sustratos27. En las células de E. coli, el 5% del genoma total está representado por la familia de proteínas más grande de transportadores ABC que contiene 80 sistemas diversos28. En nuestro estudio, las lecturas transcriptómicas que codifican los sistemas transportadores ABC bajo la influencia de una luz iluminada de 465 nm estaban reguladas negativamente en comparación con otras, como los genes implicados en el sistema de transporte de oligopéptidos (oppB, oppC, oppF), el sistema de transporte y liberación de lipoproteínas (lolA, lolB). , lolC, lolD), sistema de transporte de histidina (hisP) y sistema de transporte de lisina/arginina/ornitina (argO). Estas proteínas de unión extracelular facilitan el transporte de sustratos al interior de la célula29. La regulación negativa de estos genes transportadores ABC podría cambiar la función importadora de la membrana para absorber nutrientes para el crecimiento celular bajo exposición a luz iluminada de 465 nm y podría ser la razón de la supresión del crecimiento de las células de E. coli O157:H7 en comparación con las células cultivadas. bajo iluminación de 520 nm y 625 nm y control sin iluminación.

Además, una serie de enzimas participan en la reducción y oxidación de la glucosa a acetil-CoA y finalmente a dióxido de carbono con la producción de energía. La vía convierte NAD+ y FAD en NADH y FADH2, respectivamente, con la producción de un GTP. Luego, en la vía de la fosforilación oxidativa, este NADH y FADH2 producen ATP30. En nuestro estudio, basado en lecturas transcriptómicas, los genes involucrados en la vía metabólica de la glucosa, principalmente la glucólisis, el ciclo de TCA, las interconversiones de pentosas fosfato, pentosas y glucuronato, fructosa y manosa, galactosa, ascorbato y aldarato, y los genes del metabolismo del almidón y la sacarosa, se redujeron significativamente. regulado en E. coli O157:H7 cultivada bajo iluminación de 465 nm en comparación con el control iluminado y no iluminado de 520 nm y 625 nm, que mostró una menor producción de NADH y FADH2 y agotamiento de energía durante el metabolismo de los carbohidratos en fase exponencial (Fig. 3) .

Sin embargo, el metabolismo de los ácidos grasos produce una mayor cantidad de energía que otras fuentes de carbono debido a su disponibilidad en un estado de alta reducción y menor oxigenación y juega un papel vital en la adaptación bacteriana durante la fase estacionaria31. Los genes relacionados con el metabolismo y la degradación de los ácidos grasos estaban regulados positivamente en E. coli O157:H7 cultivada con una iluminación de 465 nm en comparación con una iluminación de 520 nm y 625 nm y un control sin iluminación. Estos genes están implicados en la escisión por β-oxidación de ácidos grasos de cadena larga en acetil CoAs. En primer lugar, una proteína fadL asociada a la membrana externa y una acil-CoA sintasa de la membrana interna fadD activan el mecanismo de acilo involucrado en el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana celular bacteriana, y luego fadE convierte la acil-CoA en enoil-CoA32. Un complejo tetramérico formado por dos copias de fadB y fadA completa las etapas finales de la degradación de los ácidos grasos, que incluyen hidratación, oxidación y escisión tiolítica. La vía de β-oxidación funciona de manera cíclica, acortando la entrada de acil-CoA en dos átomos de carbono para producir acetil-CoA después de cada ciclo. Los resultados mostraron que E. coli O157:H7, bajo la influencia de una luz iluminada de 465 nm, podría utilizar ácidos grasos como fuente de energía alternativa para sobrevivir.

Además, bajo la tensión de una luz iluminada de 465 nm, E. coli O157:H7 podría utilizar un sistema de motilidad flagelar para su supervivencia y adaptación a condiciones favorables. Las bacterias utilizan la motilidad flagelar en respuesta a estímulos ambientales como el pH, la temperatura, diversas sustancias químicas, el potencial redox y la osmolaridad que permiten a las células bacterianas adoptar entornos favorables para el crecimiento y la supervivencia33. Para la motilidad, las células de E. coli consumen suficiente proteína celular y energía para la biogénesis del sistema de motilidad flagelar34,35. La expresión de genes relacionados con la motilidad tiene un efecto sobre la reducción del crecimiento bacteriano, ya que la motilidad flagelar consume una cantidad suficiente de contenido de nutrientes y proteína celular necesarios para la rotación bacteriana36,37. En nuestro estudio, observamos las lecturas transcriptómicas de E. coli O157: H7 bajo iluminación de 465 nm relacionadas con la motilidad flagelar muy regulada en comparación con el control no iluminado (Fig. 5C). Esta regulación positiva de los genes relacionados con la motilidad podría ser responsable de la reducción del crecimiento bacteriano, la regulación negativa de los genes metabólicos de los carbohidratos y la regulación positiva de los genes de degradación de los ácidos grasos.

Además de esto, los datos transcriptómicos también mostraron que las luces LED también afectan la capacidad de detección de quórum (QS) de E. coli O157:H7. Las células bacterianas se comunican a través de QS y monitorean la densidad celular de la población en función de la concentración de moléculas de señalización en el entorno circundante y expresan genes en consecuencia38,39. La molécula señal de los autoinductores-2 (AI-2) es un sistema de señalización entre especies codificado por el gen luxS que interconvierte las moléculas de AI-2 en 4,5-dihidroxi-2,3-pentanodiona (DPD)38,40. Nuestro estudio demostró que las lecturas transcriptómicas del luxS se regulaban en gran medida a la baja bajo luz iluminada de 465 nm en comparación con otros. Las cepas patógenas utilizan QS para regular los factores de virulencia y la regulación negativa del gen luxS demostró que la comunicación entre células bajo luz iluminada de 465 nm podría disminuir y también el potencial de virulencia.

En conclusión, la luz azul iluminada a 465 nm redujo en gran medida el crecimiento de E. coli O157:H7 en comparación con el control iluminado y no iluminado a 520 nm y 625 nm. Los resultados de los DEG mostraron que algunos genes de E. coli O157:H7 responden de manera diferencial bajo luz iluminada de 520 nm y 625 nm en comparación con los grupos de control no iluminados. La expresión genética de E. coli O157:H7 cambió enormemente bajo luz iluminada de 465 nm; específicamente, los genes relacionados con el metabolismo de la glucosa se regularon a la baja de manera significativa, lo que provocó una regulación positiva de los genes de degradación de ácidos grasos y de fosforilación oxidativa durante la fase estacionaria temprana. Además, los genes relacionados con la motilidad también fueron regulados positivamente para adaptarse a nichos favorables y sobrevivir bajo el estrés de la iluminación LED de 465 nm. En general, estos resultados podrían ayudar a comprender la respuesta de E. coli O157:H7 bajo la longitud de onda de diferentes LED. El análisis comparativo de diferentes longitudes de onda con el grupo de control no iluminado basado en lecturas transcriptómicas reveló que las actividades metabólicas de E. coli O157:H7 se vieron significativamente afectadas en condiciones de iluminación.

En este estudio se utilizó E. coli O157:H7 (C7927; aislado de sidra de manzana) obtenida del Dr. Kun-Ho Seo de la Universidad de Konkuk, República de Corea, como cepa modelo, ya que se aisló de productos frescos. Se activó un cultivo congelado de E. coli O157:H7 mediante incubación durante 24 horas a 37 °C en 10 ml de caldo de triptona y soja estéril (TSB; Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido). El cultivo se centrifugó a 3500 xg durante 10 minutos a 4 °C y se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Biosesang, Seongnam-si, Corea). Las células del sedimento resultante se resuspendieron en 1 ml de PBS y se diluyeron en serie hasta aproximadamente 104 UFC/ml usando PBS. La última dilución en serie de 104 UFC/ml se realizó en 10 ml de TSB estéril para iluminación LED.

Se compraron LED de alta intensidad (10 W) con longitudes de onda de 465, 520 y 625 nm de Shenzhen Getian Opto-Electronics Co., Ltd. (Shenzhen, Guangdong, China). La especificación de cada LED se describió en la Tabla 1. Los LED (8 por 8 mm) se conectaron a un disipador de calor y un ventilador para reducir la transferencia de calor a la suspensión celular. Cada sistema LED estaba rodeado con una carcasa de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) para evitar la penetración de la luz externa durante la iluminación LED que se ilustra en la Fig. 6. Para la iluminación LED, los 10 ml de suspensión celular en TSB se transfirieron a un recipiente de petri estéril. plato (57 mm de diámetro) con 8 mm de profundidad y colocado directamente debajo de las bombillas LED a una distancia de 80 a 150 mm para ajustar la densidad de flujo de fotones fotosintéticos (PPFD) de 300 μmol/m2s, que es la condición óptima para la iluminación LED de la lechuga. en la fábrica de la planta21,41. El PPFD de cada LED en el sistema se midió usando un medidor PPFD (PAR-100, J&C Technology, Gimcheon-si, Corea) a la misma distancia. La temperatura de TSB en cada sistema LED se controló con un termómetro termopar Fluke 5.4 (Everett, WA, EE. UU.) durante la iluminación LED durante 4 h.

Montaje experimental para comprobar el crecimiento de E. coli O157:H7 bajo la influencia de luz de diferentes longitudes de onda.

Se iluminaron diez mililitros de suspensión celular en TSB con LED de 465, 520 y 625 nm durante 24 a 30 h a la temperatura establecida de 24,5 °C. El crecimiento celular bajo iluminación LED se controló periódicamente mediante muestreo a intervalos de tiempo apropiados, diluyendo en agua de peptona al 0,1% (peso/vol) (PW; Oxoid) y sembrando en agar de soja tríptico (TSA; Oxoid). Las células cultivadas en condiciones de oscuridad (sin iluminación) a la temperatura establecida de 25 °C sirvieron como control en este estudio. El número de células viables expresado como log UFC/ml se representó frente al tiempo. Las curvas de crecimiento se generaron ajustando los datos a la ecuación de Baranyi y Roberts (1994) utilizando DMFit (https://browser.combase.cc/DMFit.aspx) y los parámetros de crecimiento, a saber, duración de la fase de retraso (LPD), Se calcularon la tasa de crecimiento específico (GR), el tiempo de duplicación (DT) y la densidad máxima de población (MPD). Con base en la curva de crecimiento, también se determinó el tiempo para la fase estacionaria temprana de las células bajo cada iluminación LED y las células se recolectaron para determinar su tolerancia a cada condición de estrés y análisis de secuencia de ARN.

El análisis transcriptómico se llevó a cabo por triplicado de células de control iluminadas y no iluminadas con LED para comprender mejor las diferencias en la respuesta transcripcional de E. coli O157:H7 entre LED de 465, 520 y 625 nm y células de control no iluminadas. Las células de E. coli O157:H7 no iluminadas e iluminadas para la fase estacionaria temprana se estabilizaron con un reactivo bacteriano protector de ARN (Qiagen, Hilden, Alemania) y el ARN total se aisló utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen) con un giro eliminador de ADNg. columna (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. La concentración y la pureza del ARN extraído se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoVue Plus (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) y la integridad se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa.

Para la construcción y secuenciación de la biblioteca, se realizaron muestras de ARN total por triplicado en Macrogen Inc. (Seúl, República de Corea). Brevemente, el ARNr en el ARN total se agotó con un kit de eliminación de ARNr Epicenter Ribo-Zero (Bacteria) (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) y luego se construyeron bibliotecas de secuenciación mediante un kit de preparación de muestras de ARN total trenzado TruSeq (Illumina Inc. .) según las instrucciones del fabricante. Los datos genómicos se generaron en un sistema HiSeq 4000 (Illumina Inc.) utilizando un protocolo de extremos emparejados y una longitud de lectura de 2 × 100 pb. La calidad de las secuencias sin procesar se verificó utilizando el software FastQC (versión 0.11.7; Babraham Bioinformatics, Cambridge, Reino Unido). Antes del análisis, las lecturas sin procesar de extremos emparejados se recortaron y la calidad se filtró utilizando un programa Trimmomatic42 (versión 0.38) y se generó eliminando secuencias de adaptadores, bases de baja calidad (longitud de calidad de base <3 y tamaño de ventana deslizante 4 y puntuación de calidad 15). y lecturas cortas (< 36 pb). Después del control de calidad, las lecturas recortadas se mapearon en el genoma de referencia de E. coli O157:H7 (GenBank: GCF_000008865.2, NCBI: asm886v2) utilizando un programa Bowtie (versión 1.1.2; http://bowtie-bio.sourceforge. net/index.shtml). El número de lecturas asignadas a cada gen se contó con un programa HTseq (versión 0.10.0; http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/overview.html) para medir la expresión. El ensayo de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se analizó con el método de lecturas por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (RPKM). El análisis estadístico se realizó con el cambio de veces (FC), la prueba T independiente y la agrupación jerárquica. Se seleccionaron las condiciones de |FC|≥ 2 y el valor P bruto de la prueba T independiente <0,05. El análisis de agrupamiento jerárquico se llevó a cabo con distancias euclidianas y linaje completo como medidas de similitud de cada gen en cada muestra. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó siguiendo el método descrito por Curiel et al.43.

Los genes funcionales de E. coli O157:H7 iluminada con LED se identificaron a partir de genomas usando Prokka con parámetros predeterminados44 y se anotaron funcionalmente usando BlastKOALA (//www.kegg.jp/blastkoala/)45. En cada categoría KEGG, la expresión transcripcional de los genes se muestra como la suma de los números de lectura por kilobase de cada secuencia codificante por millón de lecturas mapeadas (RPKM) de lecturas de ARNm, asignadas a cada categoría funcional KEGG. Además, basándose en los números de KEGG Orthology (KO) de los genes funcionales, se generaron rutas metabólicas de las células iluminadas por LED y las células de control no iluminadas de E. coli O157:H7 en el módulo iPath v3 (https://pathways .embl.de/)46. Los niveles transcripcionales de las vías KEGG de E. coli O157:H7 bajo iluminación LED y sin iluminación se representaron relativamente utilizando diferentes grosores de línea y brillo de color según la suma de los valores RPKM de todos los genes funcionales.

Todos los experimentos se repitieron por triplicado y los datos se presentaron como medias ± desviación estándar. Para el análisis estadístico se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 25 (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, EE. UU.). La importancia se verificó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de rango múltiple de Duncan. La significación se estableció en P <0,05.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles públicamente en el Archivo de lectura de secuencias (SRA) del NCBI con los números de acceso SRX18394425 a SRX18394436 (número de acceso de NCBI BioProject PRJNA905884).

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Educación (No. 2017R1D1A1B04031128) y (No. 2021R1A6A1A03046418).

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Min Jeong Kim

Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Universidad Nacional de Transporte de Corea, 61 Daehark-Ro, Jeungpyeong-Gun, Chungbuk, 27909, República de Corea

Hyun Gyun Vamos

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Conceptualización, HGY y MJK; metodología, HGY y SAK; software, MJK, SAK; validación, SAK, HGY; análisis formal, SAK, HGY; investigación, SAK; recursos, HGY, MJK; curación de datos, HGY, MJK y SAK; redacción: preparación del borrador original, SAKHGY y MJK; redacción: revisión y edición, HGY y MJK; visualización, SAKHGY y MJK; supervisión, HGY y MJK; administración de proyectos, HGY; adquisición de financiación, HGY Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Hyun-Gyun Yuk.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Khan, SA, Kim, MJ. y Yuk, HG. Respuesta transcripcional de todo el genoma de Escherichia coli O157:H7 a diodos emisores de luz con varias longitudes de onda. Informe científico 13, 1976 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28458-7

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Recibido: 17 de noviembre de 2022

Aceptado: 18 de enero de 2023

Publicado: 03 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28458-7

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