un rayo ultravioleta

Virology Journal volumen 19, Número de artículo: 29 (2022) Citar este artículo

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La luz ultravioleta (UV) se ha establecido previamente como un método útil de desinfección, con eficacia demostrada para inactivar una amplia gama de microorganismos. La llegada de los diodos emisores de luz ultravioleta proporciona ventajas en la facilidad de desinfección, ya que se puede administrar UV germicida con la misma unidad de luz que proporciona luz blanca estándar para iluminar una habitación. Aquí demostramos la eficacia y viabilidad de los diodos emisores de luz ultravioleta como medio de descontaminación mediante la inactivación de dos modelos de virus distintos, el coronavirus humano 229E y el virus de la inmunodeficiencia humana. Es importante destacar que la misma dosis de luz ultravioleta que inactivó los virus humanos también provocó la inactivación completa de las esporas bacterianas resistentes a los rayos ultravioleta (Bacillus pumilus), un estándar de oro para demostrar la desinfección mediada por los rayos ultravioleta. Este trabajo demuestra que segundos de exposición a diodos emisores de luz ultravioleta (UV-LED) pueden inactivar virus y bacterias, destacando que los UV-LED podrían ser una herramienta útil y práctica para una amplia desinfección de espacios públicos.

La desinfección de fómites sigue siendo una medida importante de salud pública para reducir la propagación de una variedad de enfermedades transmisibles, especialmente durante una pandemia en curso. Con el reciente reconocimiento del papel que el contacto cercano y el hacinamiento en interiores tienen en la transmisión de virus [1, 2], ciertamente existe un interés en desarrollar tecnologías que proporcionen una desinfección frecuente y de alto rendimiento, especialmente de espacios públicos con mucho tráfico.

Los desinfectantes químicos convencionales utilizados en espacios clínicos y de laboratorio, si bien son efectivos, no son una opción práctica para implementar a gran escala debido a los peligros ambientales, de salud pública y de infraestructura asociados con los ingredientes activos. Además, el uso de desinfectantes químicos incluye la variabilidad en la eficacia aportada por el usuario y su atención a protocolos de limpieza reproducibles y prudentes. Como alternativa, la radiación ultravioleta (UV) se puede automatizar para administrar una dosis germicida reproducible y se ha utilizado ampliamente para inactivar varios microbios, incluidos varios tipos de virus [3,4,5,6,7,8,9,10 ]. El desarrollo de diodos emisores de luz (LED) UV ofrece el mismo nivel de descontaminación que las lámparas de mercurio convencionales, pero con varias ventajas [11, 12], incluida la facilidad de adaptación en una gama de fuentes de luz aéreas típicas, con mayor Capacidades de desinfección. La utilidad de los rayos UV para la desinfección queda subrayada por su sencillo mecanismo de acción. Las bases de nucleótidos del ADN y el ARN absorben fotones ultravioleta, pero, de manera singular, las bases de timina adyacentes (o uracilo, en el caso del ARN) sufren dimerización, alterando la estructura de las secuencias de nucleótidos e introduciendo "obstáculos" en la replicación del genoma [13].

Aquí demostramos la eficacia antiviral de un módulo UV-LED al inactivar dos virus distintos, el coronavirus humano estacional 229E (hCoV-229E) y el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Al utilizar un método de dispersión de gotas para imitar los fenómenos ambientales típicos de eliminación de virus (p. ej., estornudos, tos, gotas de sangre), mostramos reducciones significativas en la replicación viral a los pocos segundos de la exposición a los LED UV. Nuestro trabajo se suma a la creciente literatura sobre la aplicación de LED UV para la desinfección de espacios públicos de alto contacto. Dado que los LED UV son de bajo costo y se instalan fácilmente en una variedad de artefactos de iluminación existentes, representan una capa adicional y altamente eficaz de protección contra la propagación de patógenos, particularmente en tiempos de una pandemia de virus respiratorios en curso.

La línea celular TZM-bl se obtuvo del Programa de reactivos para el SIDA de los NIH (n.º de catálogo ARP-8129) y se mantuvo en DMEM con alto contenido de glucosa (4,5 g L-1) (n.º de catálogo de Wisent 319005-CL). MRC-5 se mantuvo en EMEM (ATCC cat# 30-2003) y Huh7 en DMEM bajo en glucosa (1 g L-1) (Gibco cat# 11885-084). Todos los medios se complementaron con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (v/v) (FBS; Wisent cat# 098150), 100 U mL-1 de penicilina y 100 µg mL-1 de estreptomicina (Fisher Scientific cat# 15140122), y todos Las líneas celulares se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.

Las reservas de VIH-1 IIIB se generaron mediante la infección de la línea de células T A3R5.7 (NIH ARP cat# 12386). En resumen, las células se sedimentaron y se resuspendieron en 1 ml de aislados de VIH-1 IIIB durante 4 h antes de agregar medio nuevo. Los sobrenadantes que contenían virus se recogieron entre 10 y 12 días después, se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C. Para cuantificar la concentración de virus y estandarizar los datos de entrada para los ensayos de infección, se midieron los niveles de proteína de la cápside p24 del VIH-1 utilizando el kit de detección AlphaLISA p24 siguiendo las instrucciones del fabricante (PerkinElmer). Las lecturas de absorbancia se realizaron en un lector de placas multimodo Synergy NEO 2 (BioTek) equipado con el software Gen 5 (v. 3.08).

El coronavirus humano 229E de tipo salvaje (hCoV-229E) y que expresa EGFP (229E-EGFP) se produjo infectando células MRC-5 durante 48 h (hCoV-229E) o células Huh7 durante 72 h (229E-EGFP) a 34 ° C, después de lo cual se dividieron en alícuotas los sobrenadantes libres de células y se almacenaron a -80 °C. Ambas reservas de virus se titularon en células Huh7 (2 x 104 células/pocillo; placa de 96 pocillos) superponiendo 50 µl de diluciones en serie 1:10 de sobrenadantes que contenían virus en DMEM sin suero durante 1 h de adsorción a 34 °C. , como se describe de manera similar [14]. A continuación, se eliminó el inóculo y se reemplazó con 200 µl de DMEM + FBS al 2 % (v/v) y se controló la infección durante 5 días a 34 °C. Los cálculos de TCID50 basados en el efecto citopático observable se realizaron como se describió anteriormente [15].

Los LED UV se suministraron en dos juegos, nueve LED de 275 nm en una matriz de 3 × 3 y veinte LED de 380 nm en una matriz de 4 × 5. Los LED estaban aproximadamente a 5 cm de la muestra irradiada, y cada conjunto emitía entre 0,4 y 0,6 mW/cm2 de luz UV. El tiempo máximo de irradiación fue de 30 s, lo que dio como resultado una dosis total administrada para los conjuntos combinados de 8 mJ/cm2 a 20 mJ/cm2 a las muestras irradiadas. El área iluminada fue sustancialmente mayor que la muestra irradiada, con el área iluminada total del dispositivo de aproximadamente 10 cm por 20 cm, o un total de 200 cm2, lo que resultó en una dosis área total de 1,6 J a 4 J.

Los discos de acero inoxidable inoculados con esporas de Bacillus pumilus se obtuvieron a través de Mesa Labs (cat# DPSSC/3). Los discos se expusieron por ambos lados a la luz ultravioleta durante los tiempos especificados y se cultivaron en soja tríptica (Fisher Scientific cat# DF0370-17-3). Los cultivos se incubaron durante siete días a 33 °C en condiciones aeróbicas. Para las mediciones de turbidez, las muestras se transfirieron a placas de 96 pocillos (FroggaBio cat# 92096) por duplicado y las mediciones de densidad óptica (OD, 600 nm) se determinaron utilizando el lector de placas multimodo Synergy Neo2. La presentación de los datos finales se realizó en Prism (GraphPad, v.9.1.2) para todos los experimentos.

Para la exposición a los rayos UV, el virus madre (82 ng mL-1 p24) se diluyó y se dispersó en gotas de 7 µL, se expuso a los rayos UV durante 30 s y luego se volvió a combinar para analizar mediante titulación TZM-bl. Se superpusieron células TZM-bl a 1,5 x 104 células/pocillo sobre las diluciones de virus en placas de 96 pocillos. Después de 4 días de cultivo, las células se lisaron y se incubaron en BriteLite Plus (Perkin Elmer cat# 6066766) durante 10 minutos a temperatura ambiente, se transfirieron a placas Opti plateadas opacas (Perkin Elmer) para la lectura de luminiscencia en el lector de placas multimodo Synergy Neo2. equipado con Gen5 (v.3.08) (BioTek).

Para la exposición a los rayos UV del hCoV-229E de tipo salvaje, se prepararon muestras en DMEM sin suero (MOI 0,1, 0,01 y 0,0001), se distribuyeron en gotitas de 7 µl y se expusieron a los rayos UV durante 30 s. Después de la exposición, se recogieron gotitas de virus y se diluyeron a 700 µl en DMEM sin suero. Todo el inóculo se superpuso sobre monocapas de 6 x 105 células Huh7 sembradas en placas de 6 pocillos 24 h antes. Las células inoculadas se incubaron durante 1 h a 34 °C para permitir la adsorción antes de agregar DMEM + FBS al 2 % (v/v) para un volumen final de 2 ml/pocillo. Después de 48 h de infección, se tripsinizaron las monocapas, se recogieron y se extrajo el ARN total utilizando el kit GENEzol TriRNA (Geneaid Biotech n.º de catálogo 12183020). La pureza y la cuantificación del ARN se realizaron en el lector de placas multimodo Synergy Neo2 de BioTek utilizando el adaptador Take3. La PCR en tiempo real se realizó utilizando la mezcla maestra de 1 paso TaqMan Fast Virus (Thermo Fisher cat# 4444432). Se obtuvieron ensayos optimizados de cebador-sonda TaqMan de Thermo Fisher para la detección de ARNr 18S eucariota (n.º de cat. 4453320, ID del ensayo: Hs99999901_s1) y hCoV-229E (n.º de cat. 4331182, ID del ensayo: Vi06439671_s1). La PCR se realizó en Quant Studio 3 y se utilizó el módulo de cuantificación relativa basado en la nube de Thermo Fisher para el análisis de datos.

Para los experimentos con hCoV-229E que expresa EGFP, el virus madre se diluyó 1:30 (similar a MOI 0,01) y se irradió como se describió anteriormente y se usó para infectar monocapas de 2 × 104 células Huh7 en placas de 96 pocillos. Las células inoculadas se incubaron durante 1 h a 34 °C para permitir la adsorción antes de agregar DMEM + FBS al 2 % (v/v) para un volumen final de 0,2 ml/pocillo. Después de 72 h de infección, se recogieron las células, se fijaron (2 % v/v de PFA) y se analizó la fluorescencia de GFP en el BD LSR Fortessa, y los análisis se realizaron en FlowJo (v.10.7.2).

Para establecer primero la eficacia del UV-LED, inactivamos las esporas de B. pumilus, que se reconocen como un indicador biológico estándar para la esterilización mediante radiación ionizante. Debido a la resistencia bien caracterizada a la radiación UV [16,17,18], B. pumilus se puede utilizar en estudios de desinfección UV como organismo sustituto de patógenos resistentes a los UV [19]. Un análisis cinético que evaluó diferentes tiempos de exposición a LED UV reveló que el crecimiento bacteriano se redujo con tan solo 15 s de exposición, pero una reducción > 2-Log (99%) requirió al menos 20 s de exposición a UV (Fig. 1). Como referencia, el nivel de turbidez observado en los discos irradiados durante > 20 s fue comparable a la turbidez de los controles negativos (solo medio) y los discos que se esterilizaron en autoclave (datos no mostrados).

Análisis cinético del crecimiento de Bacillus pumilus después de la exposición a los rayos UV. Discos de acero inoxidable inoculados con esporas de Bacillus pumilus se expusieron a rayos UV durante los tiempos especificados, después de lo cual los discos se usaron para inocular cultivos líquidos. Después de siete días en cultivo, se tomaron lecturas de la densidad óptica (OD, 600 nm). La reducción logarítmica se calculó tomando el logaritmo de base 10 del cociente (N0/N), donde N0 y N representan los discos no tratados e irradiados, respectivamente. Los datos son la media ± DE de cuatro réplicas experimentales en dos experimentos independientes. Las mediciones de DO se realizaron por triplicado.

Anticipamos que la cinética de la inactivación mediada por rayos UV observada en esporas bacterianas resistentes a los rayos UV puede ser diferente en los virus en replicación, por lo que evaluamos la inactivación cinética del coronavirus humano estacional 229E (hCoV-229E). Utilizamos un hCoV-229E recombinante en el que se reemplazó ORF4 con GP-EGFP [20, 21] (229E-EGFP, en adelante), lo que permitió la fluorescencia de EGFP como lectura de infección. El análisis de citometría de flujo de las células Huh7 evaluadas tres días después de la infección reveló una fracción reproducible de células infectadas en ausencia de exposición a LED UV (Fig. 2, eventos de EGFP + al 21,3 % a 0 s). Con una mayor exposición al UV-LED, la proporción de células infectadas disminuyó sustancialmente, a solo el 0,4% de las células a los 30 s de exposición, similar a la proporción de células positivas para GFP de fondo observadas en la muestra infectada simulada (0,023%).

Análisis cinético de la infección por hCoV-229E después de la exposición a los rayos UV. hCoV-229E-EGFP se expuso a los rayos UV durante tiempos variables y las células susceptibles se infectaron durante 3 días, después de lo cual se recolectaron y analizaron mediante citometría de flujo para determinar la fluorescencia de EGFP (filtro FITC). Los gráficos de FSC-W frente a EGFP muestran las células EGFP + en el cuadrante inferior derecho, con el porcentaje de células positivas anotado. Los datos mostrados son representativos de tres réplicas experimentales con resultados similares.

A continuación, evaluamos la capacidad de UV-LED para inactivar una variedad de títulos de virus, utilizando el virus de inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-1) como modelo de virus adicional. El VIH-1 es un retrovirus humano envuelto con un genoma que consta de dos hebras idénticas de ARN encerradas en un núcleo de nucleocápside [22]. Probamos tres niveles de VIH-1 de entrada que se diluyeron en serie diez veces, observados con una intensidad de luminiscencia que está aproximadamente diez veces separada en la Fig. 3A (barras UV negativas en gris). Por el contrario, con 30 s de exposición a los rayos UV (UV+), la infectividad se redujo notablemente (Fig. 3A, barras moradas); Reducción del 93%, 92% y 88% para las diluciones de virus 1:10, 1:100 y 1:1000, respectivamente. De manera similar, evaluamos la inactivación de varios títulos de hCoV-229E de tipo salvaje para determinar si las diferencias de inactivación UV dependientes de MOI se pueden reproducir utilizando un modelo de virus alternativo. Después de la presencia/ausencia de tratamiento con UV durante 30 s, se aisló el ARN total de las células infectadas 48 h después de la infección y se sondearon las transcripciones de hCoV-229E mediante qPCR. La replicación viral se redujo efectivamente después de la exposición a los rayos UV, como lo muestra la disminución de las transcripciones de hCoV-229E (Fig. 3B, barras grises sin tratamiento frente a barras moradas tratadas con UV), lo que representa una reducción de 1,5, 5,5 y 5,8 log para MOI 0,1, 0,01. y 0,001, respectivamente. Esto probablemente refleja una susceptibilidad dependiente de MOI a la inactivación por UV, en el sentido de que las muestras virales con títulos altos son más difíciles de inactivar que las muestras con menos partículas virales. Estas diferencias más grandes no fueron evidentes con los experimentos con VIH (Fig. 3A), presumiblemente debido al uso del ensayo indicador TZM-bL utilizado para evaluar la infección, que incluye una luminiscencia de fondo (RLU) consistente de las células indicadoras utilizadas [23 ].

Los rayos UV inactivan eficazmente virus de distintos títulos. A Las diluciones de VIH-1 IIIB se dejaron sin tratar (UV-, barras grises), se irradiaron con UV (UV+, barras moradas) durante 30 s. La replicación del virus después del tratamiento se determinó midiendo la luminiscencia (RLU, unidades relativas de luz) de una línea celular informadora basada en luciferasa. Las barras son media ± DE de lecturas de luminiscencia duplicadas y son representativas de tres experimentos independientes. B Tres MOI de hCoV-229E se dejaron sin tratar (UV-, barras grises) o se irradiaron con UV durante 30 s (UV+, barras moradas). La replicación del virus se determinó midiendo la cantidad relativa (Rq) de transcripciones de hCoV-229E mediante qPCR en ARN total aislado de células infectadas. Se usó ARNr 18S eucariótico para el control endógeno y se usaron células infectadas de forma simulada como muestra de referencia para Rq. Las barras son la media ± DE de ensayos de qPCR por triplicado y son representativas de dos experimentos independientes.

En conjunto, este trabajo demuestra la eficacia de un módulo UV-LED como medio de descontaminación al inactivar (1) esporas bacterianas resistentes a los rayos UV, (2) VIH-1 y (3) el coronavirus humano 229E, observando hasta un 5,8 -Reducción logarítmica de la replicación viral, en el caso del coronavirus humano. Si bien no evaluamos directamente si esta reducción en la replicación de hCoV-229E se correlaciona con una reducción similar en la infectividad, sí anticipamos una reducción similar en la infectividad después de la exposición a los rayos UV, dado que el mecanismo específico de inactivación por la irradiación UV es el daño al ARN y el hCoV. -229E es un virus de ARN. En este estudio reconocemos que nuestros modelos de virus seleccionados eran todos virus envueltos, elegidos para evaluar cualquier diferencia potencial en la susceptibilidad a los rayos UV debido a la longitud del genoma viral [24] y, por lo tanto, advertimos que nuestros resultados no se pueden aplicar directamente para evaluar la eficacia en la desinfección de virus no. -virus envueltos, ya que generalmente son más resistentes a los rayos UV que los virus envueltos. Sin embargo, creemos que nuestros experimentos que muestran la inactivación de las esporas de B. pumilus, conocidas por su alto nivel de resistencia a los rayos UV, pueden proporcionar una primera indicación de la inactivación por rayos UV de virus no envueltos. De hecho, se han sugerido las esporas de B. pumilus como sustituto para evaluar la inactivación del adenovirus humano no envuelto mediante irradiación UV [19]. Es importante destacar que se necesitan estudios adicionales que utilicen modelos de virus sin envoltura para evaluar la actividad antiviral de los LED UV más allá de los virus con envoltura probados en este estudio.

Los fómites contaminados [25] y el hacinamiento en interiores [1, 2] siguen siendo rutas importantes de transmisión de una variedad de enfermedades transmisibles, incluido el SARS-CoV-2 y otros patógenos respiratorios. La desinfección rutinaria de espacios públicos de alto contacto puede mitigar los riesgos de transmisión. Los LED UV brindan la ventaja de integrarse de manera flexible en artefactos de iluminación existentes, lo que permite la desinfección automatizada de una variedad de espacios diferentes, incluidos oficinas, centros comerciales, gimnasios y transporte público. Aunque solo observamos una reducción logarítmica de 2 a 2,5 en las esporas bacterianas, sostenemos que esta plataforma es un complemento útil a los métodos de prevención existentes y que puede implementarse fácilmente a bajo costo. Si bien la esterilización completa en espacios públicos puede no ser un objetivo alcanzable, la desinfección rutinaria de espacios de alto tránsito con exposiciones iterativas a los rayos UV a lo largo del día puede mitigar los riesgos asociados con la transmisión de enfermedades infecciosas por fómites. Nuestro trabajo se suma a la creciente literatura sobre la aplicación de LED UV para la desinfección y destaca que este método de prevención rentable puede ser un complemento importante y práctico de las estrategias de desinfección existentes para minimizar la transmisión de enfermedades transmisibles en lugares públicos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Virus de inmunodeficiencia humana

Coronavirus humano

Ultravioleta

Diodo emisor de luz

Proteína verde fluorescente

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Los Dres. Natasha Christie-Holmes y Scott Gray-Owen a través de nuestra membresía en las instalaciones del laboratorio CL3 de la Universidad de Toronto. El hCoV-229E recombinante que expresa EGFP fue donado generosamente por el Prof. Volker Thiel (Inst. de Virología e Inmunología, Universidad de Berna). Los siguientes reactivos se obtuvieron a través del Programa de Reactivos para VIH de los NIH, División de SIDA, NIAID, NIH: Células A3R5.7 (ARP-12386, aportadas por el Dr. Robert McLinden); Células TZM-bl (ARP-8129, aportadas por el Dr. John C. Kappes y el Dr. Xiaoyun Wu). Agradecemos a Kevin Andrade de SATI por iniciar la asociación entre UTSC y SATI y la conceptualización de este estudio.

Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención COVID-19 de la Alianza del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales (NSERC) (ALLRP 552685—20, RGPIN-2019-06442) otorgada a CG como investigador principal y en colaboración con Safe Antiviral Technologies Inc.

Arvin T. Persaud y Jonathan Burnie han contribuido igualmente a este trabajo.

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Toronto Scarborough, 1265 Military Trail, Room SW560, Toronto, ON, M1C 1A4, Canadá

Arvin T. Persaud, Jonathan Burnie, Laxshaginee Thaya y Christina Guzzo

Departamento de Biología Celular y de Sistemas, Universidad de Toronto, 25 Harbord Street, Toronto, ON, M5S 3G5, Canadá

Arvin T. Persaud, Jonathan Burnie, Laxshaginee Thaya y Christina Guzzo

Safe Antiviral Technologies Inc, 822 Manning Ave, Toronto, ON, M6G 2W8, Canadá

Liann D'Souza y Steven Martín

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Las contribuciones de los autores reflejan la taxonomía CRediT de CASRAI. Conceptualización: CG, SM, SUD; Adquisición de financiación: CG; Investigación: ATP, JB; Metodología: CG, ATP, JB; Administración de proyectos: CG; Recursos: CG, SM, SUD; Supervisión: CG; Validación: CG, ATP, JB; Visualización: ATP, JB; Redacción: borrador original: CG, ATP; Redacción: revisión y edición: CG, ATP, JB. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Cristina Guzzo.

No aplica.

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Reimpresiones y permisos

Persaud, AT, Burnie, J., Thaya, L. et al. Un módulo UV-LED que es altamente eficaz para inactivar los coronavirus humanos y el VIH-1. Virol J 19, 29 (2022). https://doi.org/10.1186/s12985-022-01754-w

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Recibido: 12 de noviembre de 2021

Aceptado: 24 de enero de 2022

Publicado: 10 de febrero de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01754-w

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